BrdU熒光染色檢測原理

用BrdU預處理的細胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并帶到子代細胞中。細胞經過固定和變性處理后，可用免疫學方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗標記，最后用比色法或熒光的方法進行定量測定)，從而判斷細胞的增殖能力。

BrdU熒光染色實驗步驟

1.細胞以1.5×105 /ml細胞數接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿中(內放置一蓋玻片)，培養(yǎng)1 d，用含0.4%FBS培養(yǎng)液同步化3 d，使絕大多數細胞處于G0期。

2.加入BrdU(儲液：1.0 mg/ml,終濃度為0.03 μg/ml)，37℃，孵育40min。

3.棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次。

4.甲醇/醋酸固定10 min。

5.經固定的玻片空氣干燥，0.3%H2O2-甲醇30 min滅活內源性氧化酶。

6.5%正常兔血清封閉。

7.甲酰胺100℃，5 min變性核酸。

8.冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1：50)，陰性對照加PBS或血清。

9.按ABC法進行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及BrdU陽性細胞數，計算標記指數(LI)。

注意事項

1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml雙蒸水，4℃下避光保存

2.BrdU會肌體造成不可逆損傷，使用時注意安全，避免吸入BrdU粉塵。